Tác dụng kháng khuẩn của các hạt nano bạc sinh tổng hợp trên tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Litopenaeus vannamei (Boone) bị nhiễm bệnh viêm tụy cấp hoại tử (NHPB), còn được gọi là bệnh đốm đen.
Bệnh viêm cân gan chân hoại tử ở tôm là do vi khuẩn Rickettsialike Gram âm đa hình còn được gọi là bệnh đốm đen. Ai cũng biết rằng bạc là một chất khử trùng hiệu quả, nhưng các thí nghiệm với các sinh vật dưới nước rất khan hiếm, ở cấp độ hạt nano thậm chí còn hiếm hơn. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng kháng khuẩn của các hạt nano (AgNP) đối với bệnh đốm đen ở tôm thẻ chân trắng ở Thái Bình Dương.
Do đó, AgNO3 được sử dụng như một nguồn cung cấp bạc, và các chất chiết xuất từ lá khô của cây trà xanh Camellia sinensis và neem Azadirachta indica được sử dụng làm chất khử. Các lô tôm nhiễm bệnh khác nhau được xử lý với 0,5 và 35 μg AgNP bằng cách cho ăn cưỡng bức. Sự khác biệt giữa số lượng nốt vi khuẩn trong gan tụy tôm và tỷ lệ chết so với lượng AgNP đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại mầm bệnh này.
Contents
GIỚI THIỆU MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA NANO BẠC
Một số bệnh do nhiều loại mầm bệnh gây ra như vi rút, nấm, động vật nguyên sinh và vi khuẩn, đã ảnh hưởng tiêu cực đến sản xuất tôm ở các nước sản xuất lớn như Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan và Ecuador (Lightner & Pantoja, 2003). Điều kiện nuôi thâm canh, mật độ nuôi hoặc sử dụng thức ăn có chất lượng dinh dưỡng thấp và không cân đối có thể dẫn đến căng thẳng, dẫn đến sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh.
Vì vậy, nghiên cứu để phát triển các kỹ thuật và phương pháp hiệu quả cho phép phát hiện sớm và kiểm soát bệnh là rất quan trọng. Việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi tôm bố mẹ và ấu trùng hiệu quả hơn so với giai đoạn ương giống, nơi khó thực hiện hơn nhiều. Vi khuẩn viêm cân hoại tử (đốm đen), một loại vi khuẩn nội bào như vi khuẩn Gram âm Rickettsia, đã nổi lên như một trong những bệnh chính ảnh hưởng đến nuôi tôm (Krol và cộng sự, 1991).
Trong giai đoạn cấp tính của bệnh, gan tụy của tôm bị teo trong khi ở giai đoạn mãn tính, gan tụy bị biến dạng, các ống bị hoại tử và nhiều khuyết tật khác. Căn bệnh này gây ra tỷ lệ tử vong lên đến 40% và chẩn đoán của nó dựa trên việc sử dụng các công cụ mô học và phân tử (Morales-Covarrubias, 2004; Avila-Villa và cộng sự, 2012; Nunan và cộng sự, 2013; Varela-Mejías & Peña -Navarro, 2016).
Công nghệ nano, kỹ thuật của các hệ thống chức năng ở quy mô phân tử, đã được tập trung vào ngành công nghiệp sản xuất, nhưng nó cũng đã được sử dụng trong y học như các chất phát hiện và chẩn đoán in vitro. in vivo, hình ảnh đa phương thức, hóa trị, quang trị liệu và liệu pháp miễn dịch (Giasuddin và cộng sự, 2013; Lin, 2015).
Hơn nữa, trong các hoạt động nông nghiệp, người ta đã chỉ ra rằng thuốc trừ sâu sinh học có kích thước nanomet mang lại hiệu quả cao hơn và chi phí thấp hơn so với thuốc trừ sâu thông thường, mang lại sự lựa chọn đáng tin cậy (Huang và cộng sự, 2015). Mặt khác, trong việc ứng dụng khoa học nano trong sản xuất nuôi trồng thủy sản, Khalafalla et al. (2011) báo cáo rằng các hạt nano selen có thể cải thiện sự sinh sản, tăng trưởng và tồn tại của Oreochromis niloticus (cá rô phi).
Ngoài ra, công nghệ nano có thể được ứng dụng trên thực phẩm để ngăn ngừa ô nhiễm hoặc suy thoái vi sinh vật. Một số ứng dụng khác liên quan đến phương tiện nano làm chất vận chuyển chất dinh dưỡng, thuốc, enzym hoặc thực phẩm và các chất phụ gia chống vi khuẩn (Can và cộng sự, 2011; Handy, 2012; Giasuddin và cộng sự, 2013). Một số hạt nano nhất định có thể có hoạt tính kháng khuẩn và ảnh hưởng đến nhiều loài vi khuẩn (Lu và cộng sự, 2013; Huang và cộng sự, 2015; Bakare và cộng sự, 2016).
Ví dụ, các hạt nano đồng đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn đường ruột Aeromonas hydrophila, Vibrio parahaemolyticus, và Pseudomonas fluorescens trong bạc và cá trắm cỏ (Huang và cộng sự, 2015), và Kim và cộng sự. (2007) báo cáo rằng việc sử dụng các hạt nano (AgNP) đã ức chế sự phát triển của nấm men, Escherichia coli (Escherich) và Staphylococcus aureus (Rosenbach).
Một số nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kháng khuẩn của nano bạc đối với vi khuẩn gây bệnh thường lây nhiễm cho các loài nuôi trồng thủy sản. Ví dụ, tác dụng kháng khuẩn của AgNPs được tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất Prosopis chilensis đã được thử nghiệm trên nấm Penaeus monodon bị nhiễm Vibrio cholerae, V. harveyi và V. parahaemolyticus (Kandasamy và cộng sự, 2013). Hơn nữa, tác dụng của AgNPs, được tổng hợp bằng chiết xuất trà xanh đã được thử nghiệm trên Fenneropenaeus indicus bị nhiễm V. harveyi (Vaseeharan et al., 2010). Gần đây, Juárez-Moreno et al. (2017) đã chứng minh các đặc tính kháng vi rút của AgNPs chống lại vi rút gây hội chứng đốm trắng lây nhiễm cho con non Litopenaeus vannamei.
Do đó, việc sử dụng các hạt nano chống lại mầm bệnh là một lĩnh vực đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản (Can et al., 2011; Rather et al., 2011; Selvaraj et al., 2014). Các cơ chế trên của tác dụng diệt khuẩn của bạc chủ yếu liên quan đến các nhóm sulfhydryl của các enzym và protein như glucose-6-phosphat dehydrogenase và glutathione reductase (Shukla & Chandra, 1977), bằng cách can thiệp vào các chức năng của bình. thường là protein. Nanosilver cũng ức chế sao chép DNA, và ở vi khuẩn, nó gây ra stress oxy hóa trong thành tế bào, nơi xảy ra các chức năng quan trọng của tế bào, ảnh hưởng đến việc duy trì cân bằng ion bên trong. Bằng cách này, vi khuẩn tiếp xúc với bạc cho thấy ức chế sự phát triển, mất kali và ức chế sự vận chuyển hóa học từ thành tế bào (Hwang và cộng sự, 2007; Luoma, 2008).
Người ta đã công nhận rõ rằng một số vi khuẩn sống trong không bào hoặc thực bào có thể tổng hợp một số protein và độc tố để tạo thành các lỗ trên màng không bào của vật chủ để thoát ra khỏi các bào quan này (Van der Meer-Janssen và cộng sự, 2010). Màng tế bào bị vỡ có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của các hạt nano vào tế bào chủ và một số báo cáo đã chứng minh rằng vi khuẩn Gram âm cho thấy sự nhạy cảm tăng lên đối với các hạt nano (Sondi). & Salopek-Sondi, 2004; Radzig và cộng sự, 2013), điều này làm cho phương tiện ứng cử viên thích hợp làm chất kháng khuẩn chống lại bệnh đốm đen – NHPB.
Ứng dụng của các hạt nano để ức chế sự xâm nhập của vi khuẩn trong tế bào người đã được phát hiện, nhưng không có tiến bộ nào được báo cáo trong việc chống lại bệnh đốm đen – NHPB trên các loài nuôi trồng thủy sản. Mặc dù thực tế là hoạt động chống vi khuẩn hiệu quả của nanosilver đã được chứng minh, nhưng có rất ít thí nghiệm được tiến hành trên các sinh vật sống dưới nước. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng kháng khuẩn của AgNPs đối với NHPB trên tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương, Litopenaeus vannamei.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – TÁC DỤNG CỦA NANO BẠC
Tổng hợp nano bạc
Lá khô của trà xanh (Camellia sinensis, Kuntze) và lá tươi của cây neem (Azadirachta indica, Jussieu) được sử dụng làm chất khử để xác định loài nào trong số hai loài ưa thích để sản xuất ống nano phân tán đơn. Lá neem được làm khô trong bóng tối ở nhiệt độ phòng và bảo quản trong túi giấy trong ba ngày. Quá trình tổng hợp hạt nano được thực hiện dựa trên phương pháp được mô tả bởi Vasseharan và cộng sự. (2010) với một số sửa đổi về số lượng và thời gian như sau: Đối với cả hai cây, 6 g lá khô được cho vào 60 ml nước khử ion sôi trong 2 phút, thỉnh thoảng khuấy đều. Sau đó, sau 5 phút, dịch truyền được lọc qua bộ lọc 4 μm ba lần để tách các chất rắn lơ lửng. Việc truyền dịch được thực hiện ngay trước khi bắt đầu tổng hợp các hạt nano.
Phản ứng được tiến hành trong ống nghiệm 50 ml với 1,0 ml bạc nitrat 0,01 M, 3,0 ml nước khử ion và 30 ml chất dinh dưỡng thực vật. Độ hấp thụ của phản ứng được đánh giá trong máy quang phổ Shimadzu UV-2450 cứ sau 5 phút trong 1 giờ. Để đánh giá dạng và độ phân tán của các hạt nano, một mẫu 3 μL dung dịch phản ứng được đặt và phân tích trong kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL 2000 sử dụng lưới đồng 200 mesh đã được làm khô ở nhiệt độ phòng. 6-12 giờ. Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm ImageJ 1.44 p (NIH).
Mẫu vi khuẩn đốm đen (NHPB)
Để lưu trữ mô tôm bị nhiễm bệnh đốm đen – NHPB, 60 mẫu vật sống được thu thập từ hai trại nuôi tôm (30 mẫu mỗi trại). Các trang trại được ẩn danh theo yêu cầu của người nông dân, và được xác định là Trang trại A và Trang trại B. Toàn bộ gan tụy của mỗi con tôm được mổ xẻ bằng cách sử dụng vật liệu phẫu thuật khử trùng bằng ngọn lửa trong phòng thí nghiệm. Thử nghiệm và gan tụy được chia thành ba phần như sau: một phần được đặt trong ống 1,5 mL với ethanol tuyệt đối để phân tích PCR thêm để xác nhận sự hiện diện của vi khuẩn và WSSV. Một mảnh khác được ngâm trong dung dịch Davidson để phân tích mô học. Theo Gracia-Valenzuela và cộng sự, để cấy vi khuẩn vào tôm khỏe mạnh nếu chẩn đoán PCR dương tính, mảnh thứ ba được chuyển sang chất bảo vệ lạnh (50% glycerol). (2011).
Các mẫu trong cồn và glycerol được bảo quản ở -20 ° C, và các mẫu Davidson được chuyển thành ethanol 70% để phân tích mô học. Để xác nhận sự nhiễm vi khuẩn, DNA đã được phân lập từ gan tụy đã được mổ xẻ trước đó bằng cách sử dụng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Định lượng DNA và xác minh tỷ lệ A260 / A280 được thực hiện trong máy quang phổ NanoDrop 1000. Phản ứng PCR được thực hiện bằng Illustra PuRe Taq’s PCR Ready-To-Go Particle (GE Healthcare).
Theo kết quả định lượng DNA, phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng 1 µL DNA nếu nồng độ lớn hơn 100 ng µL-1 và 2 µL nếu nồng độ DNA nhỏ hơn 100 ng µL-1. Loy và cộng sự đã mô tả một µL oligonucleotide. (1996) để chẩn đoán đốm đen – NHPB (pf-1: 5′-ACGTTGGAGGT TCGTCCTTCAG-3 ‘và pr-1: 5′-TCACCCCCTTGC TTCTCATTGT-3’) được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Điều kiện chu trình nhiệt được mô tả bởi Loy et al. (1996).
Do vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao trên các trang trại nuôi tôm ở tây bắc Mexico, một phân tích PCR cũng được tiến hành để loại trừ các mẫu xét nghiệm dương tính với vi rút. rút. Các phân tử WSSVVP28-F1: 5’-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3 ‘và WSSVVP28-R1: 5’-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3’ đã được báo cáo bởi Ramos-Paredes và cộng sự. (2012) đã được sử dụng, cũng như các điều kiện chu trình nhiệt được các tác giả này khuyến nghị. Đối chứng âm tính không có DNA được sử dụng trong mọi trường hợp.
Do vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao trên các trang trại nuôi tôm ở tây bắc Mexico, một phân tích PCR cũng được tiến hành để loại trừ các mẫu xét nghiệm dương tính với vi rút. rút. Các phân tử WSSVVP28-F1: 5’-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3 ‘và WSSVVP28-R1: 5’-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3’ đã được báo cáo bởi Ramos-Paredes và cộng sự. (2012) đã được sử dụng, cũng như các điều kiện chu trình nhiệt được các tác giả này khuyến nghị. Đối chứng âm tính không có DNA được sử dụng trong mọi trường hợp.
Do vi rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao trên các trang trại nuôi tôm ở tây bắc Mexico, một phân tích PCR cũng được tiến hành để loại trừ các mẫu xét nghiệm dương tính với vi rút. rút. Các phân tử WSSVVP28-F1: 5’-CTCGCTTGCCAATTGTCCTGT TA-3 ‘và WSSVVP28-R1: 5’-ATTTCCACCGGC GGTAGCTGC-3’ đã được báo cáo bởi Ramos-Paredes và cộng sự. (2012) đã được sử dụng, cũng như các điều kiện chu trình nhiệt được các tác giả này khuyến nghị. Đối chứng âm tính không có DNA được sử dụng trong mọi trường hợp.
Kích hoạt chất cấy của vết đen – NHPB một lần nữa
Mười con tôm sống từ quá trình nuôi thử nghiệm tại các cơ sở của Universidad de Sonora ở Bahía de Kino, Sonora đã được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong nước của chúng tôi.
Các mẫu vật được đặt trong bể 15 L nước biển đã được lọc và cho tôm ăn thức ăn thương phẩm hai lần mỗi ngày trong 5 ngày. Sau đó, không có thức ăn nào được cung cấp trong 24 giờ để làm sạch ruột và sau đó sinh vật gây áp lực gan tụy được thu hoạch từ tôm âm tính với NHPB / WSSV từ ngân hàng mô được lưu trữ. sử dụng một ống thông thích ứng với một microipette 20-100 µL, và quy trình này được lặp lại mỗi ngày thứ ba trong ba lần.
Sau 30 ngày, toàn bộ gan tụy được mổ xẻ, phần lớn được bảo quản trong glycerol và một phần nhỏ được sử dụng để tách chiết DNA và phân tích PCR về sự hiện diện của NHPB theo phương pháp đã mô tả ở trên. Các sinh vật xét nghiệm NHPB dương tính tham gia vào ngân hàng mô bị nhiễm bệnh để tiến hành xử lý nhiễm trùng và xử lý xét nghiệm sinh học bằng nano bạc.
Xét nghiệm sinh học để tìm nhiễm NHPB
Một tuần sau khi chủng NHPB được kích hoạt trở lại, một trăm chín mươi sáu g tôm sống từ các cơ sở của chúng tôi ở Bahía de Kino, Sonora, đã được chuyển đến các cơ sở trong nước của chúng tôi. . Những số lượng tôm này được xem xét về khả năng chết do xử lý, căng thẳng, ăn thịt đồng loại hoặc bệnh tật, và do đó, để đảm bảo rằng có đủ số lượng tôm sống sót để kiểm tra sinh học. Để đánh giá rằng những con tôm này không bị nhiễm cả NHPB và WSSV, 11 con tôm được chọn ngẫu nhiên và phân tích bằng PCR sử dụng DNA chiết xuất từ một con tôm thẻ chân trắng, với phương pháp được mô tả trước đây. Tất cả tôm được chuyển sang 16 bể nuôi (10 đến 12 mỗi bể) chứa 40 L nước biển đã được lọc và khử trùng bằng đèn UV và duy trì ở 28-29 ° C. Tôm được theo dõi trong ba tháng với sục khí liên tục và thức ăn công nghiệp dạng viên, cung cấp hai lần một ngày với liều lượng 5% sinh khối của chúng. Khi đó, một số con tôm chết do ăn thịt đồng loại hoặc do chúng nhảy ra khỏi bể, nhưng không con nào bị bệnh.
Thay nước 80% được thực hiện 3-4 ngày một lần với nước biển đã được lọc và khử trùng bằng tia cực tím. Một trăm hai mươi con tôm được đề cập trong đoạn trên, nặng 16 g, đã bị nhiễm NHPB do cho ăn bắt buộc sử dụng các chất gây ô nhiễm thu được trước đó. Để đảm bảo sự lây nhiễm và sự tiến triển của bệnh, tôm đã được duy trì trong 50 ngày. Điều này được thực hiện bởi vì, trong các thử nghiệm nhân giống trước đây, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh trên tôm đã được quan sát thấy sau 50 ngày. Điều trị kiểm soát bao gồm tôm không bị nhiễm bệnh. Để phát hiện nhiễm NHPB ở tôm, phân được thu thập hàng ngày. Để làm như vậy, tôm của mỗi bể nuôi được đặt trong một lưới hình trụ và để trong khoảng 30 – 40 phút để có thời gian lắng đọng phân. Phân được bảo quản trong ống 1,5 mL với> 95% etanol. Sau khi nhiễm NHPB trên tất cả tôm, chúng tôi tiến hành áp dụng phương pháp điều trị bằng nano bạc.
Phương pháp xử lý nano bạc
Từ những con tôm bị nhiễm bệnh, 45 con tôm được chọn và thành lập ba nhóm, với ba bể cho mỗi nhóm (n = 5), đối với các nghiệm thức AgNPs được giải thích như sau. nanosilver tổng hợp với A. indica được sử dụng trong hai nghiệm thức khác nhau, 5 µg và 35 µg AgNPs trong dung dịch nước, và được cho 15 con tôm ăn trong mỗi nghiệm thức, chia đều cho 5 con trong mỗi bể nuôi. Điều này được xác định bởi nồng độ cực đoan được sử dụng bởi Vaseeharan et al. (2010) chống lại Vibrio harveyi. Nhóm thứ ba của tôm nhiễm bệnh được nuôi bằng dung dịch nước không có hạt nano. Nhóm thứ tư gồm 15 con tôm không bị nhiễm bệnh mà không có hạt nano vẫn là nhóm đối chứng. Một con tôm trong mỗi bể (ba con cho mỗi lần xử lý) vào ngày 12 và 24 được thu thập, và hy sinh bằng cách hạ thân nhiệt để giảm sự trao đổi chất của nó và được xử lý ngay lập tức. Các phân đoạn cephalothorax (dày 3-5 mm) từ các sinh vật được lấy mẫu được đặt trong một hộp băng để kiểm tra mô học trong dung dịch Davidson. Một phần nhỏ gan tụy được thu thập và cho vào các ống 1,5 mL với> 95% ethanol để phân tích PCR như đã giải thích ở trên. Nhiễm trùng mô gan tụy được đánh giá về mặt mô học, dựa trên Lightner & Pantoja (2003) và Del Río-Rodríguez et al. (Năm 2006).
Xác định các chất chuyển hóa ở gan tụy Glucose gan tụy, tổng số protein, glycogen, tổng lipid, acylglycerid và sterol chiết xuất và được đo theo Sánchez-Paz et al. (2007) trong máy đọc đĩa siêu nhỏ Synergy (BioTek Instrumets), sử dụng bộ công cụ thương mại (Phòng thí nghiệm Randox). Tóm lại, một khối gan tụy đã cân được ướp với thể tích đệm A (100 mM đệm kali photphat, pH 7,2 và 1,0 mM EDTA, 10 µM PMSF) và một thể tích nước cloroform-metanol (2: 2: 1) và ly tâm ở 15.000 × g trong 15 phút. Pha nước được sử dụng để định lượng mức độ glucose, protein tổng số và glycogen. Xác định glycogen được thực hiện bằng cách thủy phân và được đo dưới dạng glucose theo Passonneau & Lauderdale (1974). Pha dung môi chứa cloroform được thu thập và làm khô trong không khí trong 12 giờ trong bóng tối hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (25 ° C), sau đó đồng nhất với nước cất và được sử dụng để định lượng tổng thể. lipid, acylglycerid và sterol. Dữ liệu về chất chuyển hóa, được biểu thị bằng mg g-1 của gan tụy, được phân tích thống kê bởi KruskalWallis phân tích phương sai một chiều với thử nghiệm so sánh nhiều lần của Dunn trong phân tích hậu sản xuất của SigmaPlot v .12.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA NANO BẠC
Tính chất của hạt nano AgNPs
Dung dịch phản ứng của Azadirachta indica khi tiếp xúc với AgNO3 cho thấy một đỉnh hấp thụ duy nhất ở 440 nm, trong khi dung dịch phản ứng của Camelia sinensis cho thấy một đỉnh hấp thụ nhỏ ở 390 nm và một đỉnh rõ rệt hơn ở 440 nm. Các dung dịch đối chiếu của AgNO3 không có đỉnh hấp thụ trong cả hai trường hợp. Các hạt nano được tổng hợp bởi A. indica cho thấy cả hai hình bán cầu và phẳng sau 120 phút thời gian phản ứng. Kích thước của nano dao động từ 5 đến 45 nm với trung bình là 14,84 ± 5,81 nm. 84,65% các hạt nano được tìm thấy trong phạm vi 5 đến 21 nm với trung bình là 13,01 ± 3,71 nm. AgNPs thu được từ A. indica là đơn nguyên do tỷ lệ cao của các hạt nano cùng loại kích thước (Hình 1a), và đây là tiêu chí để sử dụng nó trong khảo nghiệm xử lý sinh học. Mặt khác, đối với C. sinensis, sau thời gian phản ứng 120 phút, người ta đã quan sát thấy các hình đa diện, hình bán cầu, hình dẹt và một số hình dạng dây nano. Dải kích thước nằm trong khoảng từ 7,4 đến 68,8 nm với mức trung bình là 29,67 ± 14,17 nm, 29% từ 13,1 đến 20,8 nm với mức trung bình là 16,60 ± 2,2 nm và 20% là từ 37,05 đến 44,03 nm với giá trị trung bình là 40,56 ± 1,88 nm (Hình 1b). Đây là lý do đủ để loại bỏ các hạt nano này khỏi các thử nghiệm sinh học.
Phát hiện mầm bệnh
Các sinh vật từ Trang trại A chỉ ra rằng 17% dương tính với NHPB, 23% dương tính với WSSV, 3% dương tính với cả hai bệnh nhiễm trùng và 57% không có mầm bệnh.
Furthermore, samples from farm B showed that 63% were infected with WSSV, 3% had a double infection and in 33% had no detectable presence of these pathogens. NHPB chain shows 100% identity with NHPB chain U65509 of GenBank and is additionally registered with joining number KM305771.
Thử nghiệm Xét nghiệm sinh học đối với nhiễm NHPB Qua thực nghiệm, tôm bị nhiễm NHPB có các dấu hiệu lâm sàng điển hình của bệnh như: xương ngoài mềm, gan tụy giảm, bơi lội thất thường và lờ đờ (Vincent et al., 2004). Ngoài ra, kết quả này cho thấy rằng mỗi con tôm tiếp xúc với nguyên liệu bị nhiễm bệnh đều được lây nhiễm thành công vì 100% các xét nghiệm chẩn đoán cho kết quả dương tính (Hình 2).
Đáng chú ý là tỷ lệ chết của tôm được xử lý bằng NHPB được xử lý với 35 μg AgNPs là 0%, trong khi tôm được xử lý với 5 μg AgNPs có tỷ lệ chết là 40% vào cuối thí nghiệm. Các sinh vật không có hạt nano, nhưng bị nhiễm bệnh cho thấy tỷ lệ tử vong là 41%. Sau 12 ngày điều trị, quan sát thấy nhiều nốt vi khuẩn trong mô gan tụy của tôm với 5 µg AgNPs và các ống này hơi co lại và có nốt vi khuẩn (Hình 3a). Sau 24 ngày, gan tụy to lên nghiêm trọng và các nốt vi khuẩn được quan sát thấy trong mô biểu mô của ống gan tụy (Hình 3b). Trong quá trình xử lý 35 µg AgNPs, và sau 12 và 24 ngày điều trị, gan tụy của tôm có dấu hiệu bị nhiễm trùng với gan tụy bị tổn thương và biểu mô chân không nghiêm trọng (Hình 3c-3d). Mô gan tụy của tôm bị nhiễm bệnh không có ống nano cho thấy nhiễm trùng nặng kể từ mẫu đầu tiên vào ngày thứ 12, với nhiều nốt vi khuẩn và gan tụy bị teo nghiêm trọng (Hình 3e).
Chuyển hóa qua gan tụy
Phân tích thống kê các thành phần sinh hóa được phân tích ở 12 và 24 ngày thử thách vi khuẩn cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về tổng số protein (P = 0,225), acylglycerid (P = 0,174), tổng số lipid (P = 0,166), glucose (P = 0,225 ) và glycogen (P = 0,270). Tuy nhiên, có sự khác biệt về nồng độ sterol (P = 0,017), với giá trị cao hơn ở tôm bị nhiễm không nhận AgNPs (Hình 4).
Các hạt nano từ chiết xuất trà xanh và lá neem đã được tổng hợp thành công một cách nhanh chóng, thiết thực và kinh tế so với các kỹ thuật hóa học và vật lý khác (Poole & Owens, 2007; Guzmán và cộng sự, 2009). Tuy nhiên, sự khác biệt về hình dạng và độ phân tán của các hạt nano được so sánh với Vaseeharan et al. (2010) và Gavhane et al. (2012). Chiết xuất trà xanh, như một chất khử, cho thấy hai đỉnh trong phổ hấp thụ, cho thấy sự gia tăng polydispersite (Hsu & Wu, 2010; Kamal và cộng sự, 2010), được xác nhận trong kính hiển vi điện tử truyền qua.
Thông qua, nơi mà kích thước của nano bạc được phân tán rộng rãi. Trong nghiên cứu này, các hình dạng khác nhau của các hạt nano đã được quan sát, và mặc dù không rõ liệu hoạt tính kháng khuẩn có phụ thuộc vào hình dạng hạt nano hay không, nhưng có vẻ như chắc chắn. Có thể cho rằng tất cả các dạng được tìm thấy đều có thể dẫn đến tác dụng kháng khuẩn là hợp lý. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác nhận rằng cả hình thức và kích thước của các hạt nano đều không phù hợp để sử dụng trong điều trị.
Kết quả mô học của tôm nhiễm NHPB phù hợp với kết quả báo cáo của Del RíoRodríguez et al. (Năm 2006). Tôm được xử lý với 5 µg AgNPs cho thấy tổn thương mô tương tự đối với tôm bị nhiễm bệnh mà không có hạt nano, cũng bị hoại tử mô cũng như sự hiện diện của các nốt vi khuẩn và thâm nhiễm tế bào máu. Hơn nữa, trong khi tôm được xử lý với 35 µg AgNPs, một số tổn thương mô đã được quan sát thấy, không có vi khuẩn hoặc sự xâm nhập tế bào máu được tìm thấy như là bằng chứng của NHPB.
Ngoài ra, biểu mô của các ống hơi mỏng hơn và tính toàn vẹn của mô bị thay đổi. Điều này có thể cho thấy rằng điều trị bằng AgNPs loại bỏ hoặc làm giảm đáng kể NHPB trong tế bào tôm.Trong trường hợp này, phân tích PCR dương tính cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn, có thể với số lượng nhỏ, nhưng không rõ ràng như phân tích bằng kính hiển vi, hoặc DNA vi khuẩn còn sót lại từ vi khuẩn chết vẫn còn. còn ở tôm. Khả năng nano bạc vẫn còn trong mô là cao. Bianchini và cộng sự. (2007) báo cáo rằng ở Penaeus duorarum (Burkenroad), sự tích tụ bạc chủ yếu xảy ra ở gan tụy, tiếp theo là hemolymph, tuy nhiên, ở mang, cơ và mắt có rất ít sự tích tụ bạc.
Có lẽ, có một lợi ích tuyệt vời mà bạc tích tụ trong gan tụy vì nó là cơ quan đích của NHPB (Lightner và cộng sự, 1992), vì vậy hầu hết bạc sẽ có sẵn như một chất kháng khuẩn. Ngoài ra, do mối quan tâm lớn về ảnh hưởng của nanô đối với sức khỏe con người (Korani và cộng sự, 2015), và do thị trường tiêu thụ chủ yếu coi phần bụng hơn là cephalothorax, nên thực chất đây là phần cơ của tôm. Tích tụ ít hạt nano là một lợi thế.
Theo Vincent và cộng sự. (2004), diễn biến của bệnh NHPB chỉ ra rằng trong 20 ngày đầu tiên bệnh đã ở giai đoạn nặng. Sau thời gian đó, bệnh chuyển sang giai đoạn cấp tính và bắt đầu chết, từ 35 ngày sau khi nhiễm bệnh thì bắt đầu chuyển sang giai đoạn mãn tính. Trong nghiên cứu hiện tại, hành vi bình thường và các dấu hiệu lâm sàng đã được quan sát thấy ở tôm sau 20 ngày, trong khi tỷ lệ chết xảy ra trong quá trình thử nghiệm.
Tuy nhiên, giai đoạn mãn tính bắt đầu ở 56 ngày thử thách, sau khi kết thúc thử nghiệm của chúng tôi. Sự khác biệt này là với Vincent et al. (2004) nghiên cứu cần được đánh giá, tìm kiếm các biến thể di truyền NHPB hoặc tình trạng sức khỏe miễn dịch của tôm. Sự khác biệt nhỏ về tỷ lệ tử vong giữa nghiệm thức AgNPs 0 µg và 5 µg có thể chỉ ra rằng nồng độ của các hạt nano bạc không đủ để chống lại mầm bệnh, điều này phù hợp với những phát hiện trong phân tích. mô học. Hơn nữa, các sinh vật sử dụng 35 µg AgNPs có tỷ lệ sống sót là 100%, và mặc dù kết quả phân tích phân tử là dương tính vào cuối thí nghiệm, mô gần như được phục hồi về mặt giải phẫu khi so sánh với các mẫu đầu tiên. Morales Covarrubias và cộng sự. (2012) đã thử nghiệm florfenicol và oxytetracycline trên tôm nhiễm NHPB, và quan sát thấy tỷ lệ sống từ 56 đến 83%, với dư lượng kháng sinh lên đến 10 ngày trong cơ tôm.
Điều quan trọng cần lưu ý là việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản có liên quan đến việc sản xuất vi khuẩn kháng thuốc. Vi khuẩn có thể chịu đựng một số nồng độ bạc nhất định và giảm chúng để tạo thành các tinh thể nano trong không gian ngoại bào như một biện pháp bảo vệ (Klaus-Joerger et al., 2001). Tuy nhiên, hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đều không kháng thuốc nano (Parameswari et al., 2010; Saxena et al., 2010; Vaseeharan et al., 2010). Hơn nữa, người ta phát hiện ra rằng các sinh vật kháng thuốc kháng sinh, so với không kháng thuốc, đều nhạy cảm với nanoilver. Ví dụ, Lara et al. (2010) phát hiện ra rằng các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) kháng kháng sinh rất nhạy cảm với nano bạc.
Ứng dụng của các hạt nano được tổng hợp bằng cách sử dụng chiết xuất trà bao gồm các thành phần rẻ tiền và sẵn có so với các chất khử khác. Điều này có nghĩa là giảm đáng kể chi phí cũng như áp dụng các phương pháp luận đơn giản. Ngoài ra, những lợi ích của việc áp dụng các hạt nano được tổng hợp theo cách thân thiện với môi trường và với khối lượng liều lượng thấp có thể là một ứng cử viên tuyệt vời như một chất kháng khuẩn trong một số ngành nuôi tôm, chẳng hạn. ví dụ, trong việc duy trì tôm bố mẹ.
Mặc dù người ta thấy rằng các hạt nano có tác dụng kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn nội bào gây ra NHPB, nhưng cần phải hiểu cơ chế hoạt động của các hạt nano này chống lại các vi khuẩn này. Việc không có sự khác biệt thống kê trong năm thành phần sinh hóa được phân tích cho thấy không đủ bằng chứng để chứng minh rằng mức độ của các thành phần đó bị ảnh hưởng bởi tác động của nhiễm trùng và nồng độ khác nhau của các hạt nano ở tôm bị nhiễm bệnh và khỏe mạnh.
Các nghiên cứu trong tương lai nên tính đến cỡ mẫu lớn hơn để tránh các giá trị phân tán lớn như được quan sát thấy trong phân tích các chất chuyển hóa, vì các giá trị phân tán cao che lấp bất kỳ sự khác biệt nào có thể tồn tại. Điều quan trọng nữa là phải kiểm tra một loạt các nồng độ hạt nano và kiểm tra tính khả thi của việc ứng dụng các hạt nano trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản lớn, có thể thêm cả các hạt nano. Phụ gia thực phẩm.
Gần đây đã chỉ ra một tác động có hại của ống nano đối với quần thể sinh vật ven biển (Burić và cộng sự, 2015; Degger và cộng sự, 2015; Gambardella và cộng sự, 2015; Rocha và cộng sự, 2015), nhưng may mắn thay Juárez-Moreno và cộng sự. (2017) đã chứng minh rằng nano bạc ở liều điều trị không độc hại và không ảnh hưởng đến tỷ lệ trao đổi chất hoặc tổng số lượng tế bào máu ở tôm thẻ chân trắng nhỏ tuổi. Tuy nhiên, với sự phong phú của các kim loại và kim loại được sử dụng làm hạt nano, điều quan trọng là phải nghiên cứu tác động của việc sử dụng chúng đối với các loài nuôi trồng thủy sản, sức khỏe con người và môi trường ven biển. , để thực hiện các chiến lược trong tương lai để phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững và có trách nhiệm.
Martín Rodrigo Acedo-Valdez, José Manuel Grijalva-Chon, Eduardo Larios-Rodríguez, Amir Darío Maldonado-Arce, Fernando Mendoza-Cano, José Arturo Sánchez-Paz & Reina Castro-Longoria, Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Ingeniería Química y Metalurgia, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Departamento de Física, Unidad Regional Centro Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México, Laboratorio de Referencia, Análisis y Diagnóstico en Sanidad Acuícola, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C., Hermosillo, Sonora, México
